固定化酶是指被局限在某一特定區(qū)域上的、并且保留了它們的催化活力、可以反復(fù)、連續(xù)使用的酶。 與游離酶相比，固定化酶具有下列優(yōu)點(diǎn):固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開(kāi);可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分 批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性;酶反應(yīng)過(guò)程能夠嚴(yán)格控制:產(chǎn)物溶液中 沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝;較游離酶更適合于多酶反應(yīng);可以増加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量； 酶的使用效率提高，成本降低1 1-71。膠囊法固定化酶最接近自由酶的工作環(huán)境，能最大限度地保留酶的 活性。在己有的膠囊法固定化酶技術(shù)中，利用聚陰離子電解質(zhì)一海藻酸和聚陽(yáng)離子電解質(zhì)一殼聚 糖、聚賴(lài)氨酸等間的靜電作用形成多電解質(zhì)絡(luò)合物囊膜實(shí)現(xiàn)酶固定化的報(bào)道非常多18-121。羧甲基纖維 素是非常廉價(jià)的聚陰離子電解質(zhì)，也可與殼聚糖、聚賴(lài)氨酸等聚陽(yáng)離子電解質(zhì)形成多電解質(zhì)絡(luò)合膜實(shí)現(xiàn) 酶的固定化，但以羧甲基纖維素和殼聚糖為原料進(jìn)行膠囊法固定酶的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以殼聚糖 和羧甲基纖維素為原料制備羧甲基纖維素殼聚糖膠囊并用其固定蔗糖酶，考察羧甲基纖維素殼聚糖 膠囊固定化蔗糖酶的可行性。
酵母;羧甲基纖維素鈉（化學(xué)純）殼聚糖（自制，脫乙酰度大于80 % )冰醋酸（分析純）無(wú)水乙醇 (分析純）十二烷基硫酸鈉（SXS)葡萄糖(分析純）氫氧化鈉(分析純）3 5二硝基水楊酸（化學(xué)純） 蔗糖(分析純）醋酸鈉汾析純）丙三醇（分析純)等。
羧甲基纖維素殼聚糖膠囊的制備用6號(hào)注射器的針頭將殼聚糖溶液滴入到100 m^的CMC 溶液中，硬化24 1后濾出，用IH4 6醋酸緩沖溶液洗滌后得羧甲基纖維素殼聚糖膠囊。實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)考 察殼聚糖濃度、CMQ農(nóng)度、硬化時(shí)間、固定化溫度對(duì)膠囊形成效果的影響。
蔗糖酶的制備S〕S(十二烷基硫酸鈉）抽提法|131。稱(chēng)取酵母10 g加入60 mLQ 3 mmo/L的
3XS容解40°C水浴12 1后取出，4 & 12 000 r/min離心15 min上清液即為粗制酶液。在粗制酶液中 加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0 30 4 °C放置過(guò)夜，然后在4 °C下12 000 r/mn離心15 min取上清液，追加 乙醇使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0 50 4 C放置1 h在4 C下12 000 r/min離心15 mn棄上清液，沉淀分為兩 部分，一部分干燥后測(cè)定沉淀中粗酶含量;另一部分用4 6醋酸緩沖溶液配制成含粗酶0. 3%的酶 液，4 C保存?zhèn)溆谩?/div>
羧甲基纖維素殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶的制備取1. 2 2制備的粗酶液與10. 0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 02的殼聚糖溶液充分混合，按1 2 1相同的方法制備羧甲基纖維素殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶。
羧甲基纖維素殼聚糖膠囊的表征①羧甲基纖維素殼聚糖膠囊形貌觀察:將膠囊用刀片切開(kāi) 后平鋪在載玻片上晾干，用SM觀察膠囊表面形貌。②膠囊強(qiáng)度的測(cè)定：將膠囊置于離心管中，在3 000轉(zhuǎn)/mir離心30 mn后觀察膠囊的破碎或保持完整性情況來(lái)表征膠囊的膜強(qiáng)度。
膠囊的形貌表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1從圖1可以看出，羧甲基纖維素殼聚糖膠囊球形規(guī)整，分散性 好，粒徑均在3 mm左右佐上角a為膠囊照片）。SM觀察可以看出，膠囊表面較均勻地分布許多孔徑 在100~300 ni的微孔，這是反應(yīng)底物和產(chǎn)物能有效遷移通過(guò)囊膜的基礎(chǔ)。
殼聚糖和羧甲基纖維素濃度對(duì)膠囊形成的影響將殼聚糖溶液和羧甲基纖維素溶液按不同的 濃度組合制備膠囊，固化24 1后觀察成球情況;再經(jīng)3 000 r/mn離心半小時(shí)。當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0 02 CMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 015時(shí)，制得的膠囊其成球性好，球形規(guī)則，機(jī)械強(qiáng)度最好，高于或低于此濃 度時(shí)均不能得到理想的膠囊。
固定化時(shí)間對(duì)成球效果的影響以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 02的殼聚糖溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 015的CC 溶液制備膠囊，在室溫下固化不同時(shí)間，經(jīng)3 000 r/mn離心半小時(shí)后觀察膠囊的變形情況。試驗(yàn)中發(fā) 現(xiàn)，隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng)，囊膜強(qiáng)度逐漸増強(qiáng)，固定化時(shí)間為24 h后的囊膜強(qiáng)度基本不再變化，處理過(guò) 程中不再有皺縮或粘連的現(xiàn)象。
值對(duì)固定化酶活性的影響蔗糖酶在PH4 6時(shí)活性最大，試驗(yàn)中為考察固定化酶的耐酸堿 性能，分別將游離酶和固定化酶在任意1H值時(shí)的活性與各自在1H 4 6時(shí)活性的比值的變化來(lái)表征游 離酶或固定化酶活性受酸堿度的影響，測(cè)試溫度40 °C (圖2)。由圖2可知，游離蔗糖酶在1H4 6 ~5 0 范圍內(nèi)活性最高，偏離這一 1H值范圍其活性快速下降；當(dāng)體系的1H 5 5時(shí)游離蔗糖酶的活性?xún)H為最 高時(shí)的18%,當(dāng)PH3 6時(shí)其活性為最高時(shí)的63%。而殼聚糖一羧甲基纖維素膠囊固定化蔗糖酶的活 性在1H4 6的偏酸性范圍內(nèi)隨酸度増加，活性只是略有減低。當(dāng)1H值高于5 0后固定化酶的活性才 明顯降低，但其幅度也明顯低于游離酶，說(shuō)明蔗糖酶固定化后其耐酸堿性能明顯提高。
固定化酶的最適溫度體系的IH4. 6時(shí)，蔗糖酶在50 °C表現(xiàn)出最高的催化活性。游離蔗糖酶 和羧甲基纖維素殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶在不同溫度時(shí)相對(duì)于各自在50 °C的活性如圖3所示。在低 于50 °C時(shí)，體系的溫度變化對(duì)游離蔗糖酶和固定化蔗糖酶的活性影響基本相同;高于50 °C時(shí)，隨體系 溫度升高，游離酶的失活作用明顯快于固定化酶，可見(jiàn)經(jīng)羧甲基纖維素殼聚糖膠囊包封后的蔗糖酶耐 熱性能有明顯提高。