黃原膠是由野油菜黃單胞菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種酸性胞外雜多糖。由于黃原膠獨(dú)特的分子 結(jié)構(gòu)，使其具有増黏性、觸變性、假塑性等功能特性，在食品、醫(yī)藥、石油、印染等諸多方 面得到廣泛的應(yīng)用[1,2]。野油菜黃單胞菌是好氧菌，在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，隨著黏度増大，氧 的傳質(zhì)能力下降，發(fā)酵系統(tǒng)中的溶氧更低，導(dǎo)致黃原膠的產(chǎn)量難以提高。研究表明氧氣的傳 質(zhì)速率以及溶氧情況直接影響到黃原膠的產(chǎn)量與質(zhì)量[3]。雖然提高攪拌速度能有效増加氧供 給，但由于高攪拌轉(zhuǎn)速形成高剪切力，使菌體受損，導(dǎo)致生成量減小，而單純加大通風(fēng)，效 果欠佳，此外這兩種方法均造成能源過(guò)量消耗。為此，探討新的強(qiáng)化供氧途徑成為研究熱點(diǎn)。

氧載體(oxygen vectors)是一種與水不互溶、對(duì)微生物無(wú)毒、具有較高溶氧能力的有機(jī)物。 這種有機(jī)物一般具有比水更高的溶氧能力，如液態(tài)烷烴、全氟化碳、大豆油等均可作為氧載 體[4,5,6,7]。Rols等已闡明氧載體提高氧傳遞速率的機(jī)理（圖1)。氧載體發(fā)酵體系由于具有 氧傳遞速度快，能耗低，氣泡生成少，剪切力小等特點(diǎn)，受到人們重視。但是，在國(guó)內(nèi)，對(duì) 于在黃原膠發(fā)酵體系中加入氧載體的研究報(bào)道較少且不成體系。本實(shí)驗(yàn)對(duì)幾種常用有機(jī)物在 黃原膠發(fā)酵過(guò)程中作為氧載體的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)和篩選，并具體考察了氧載體加入量和加入 時(shí)間對(duì)黃原膠合成的影響。

1材料與方法 1.1菌種

野油菜黃單胞菌執(zhí)〇w〇«似caOTpeitr/iO，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2培養(yǎng)基(g/L)

種子培養(yǎng)基：蔗糖20;蛋白胨5;牛肉膏3;酵母膏1; pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 50;蛋白胨 6; K2HPO4 5; MgSO4 0.3; CaCO3 3.0;檸檬酸 1; pH 7.0。 E 培養(yǎng)基：酵母膏 3; K2HPO45; MgSO4 0.3; pH 7.0。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)

4°C保存的斜面種子于平板上劃線培養(yǎng)；挑取單菌落于種子培養(yǎng)基，180 r/mm、30 °C搖 床培養(yǎng)28 h得到種子液，以10 %接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，同等條件培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

1.4菌懸液的制備

4500 r/min、20 min離心種子液，下沉得到黃單胞菌體，所得菌體用無(wú)菌水沖洗兩次后 懸浮于無(wú)菌水制成菌懸液。備用。

1.5細(xì)胞干重的測(cè)定

取含菌液用蒸餾水離心（4500 r/min,20 min)洗滌三次后，105 C烘干24 h，稱重，單 位 g/L。

1.6產(chǎn)品收集

發(fā)酵液中加入硅藻土，振蕩10 min后離心，上清液用約3倍體積的95 %乙醇沉淀，洗 滌，再離心，收集黃原膠沉淀，50 C烘干，粉碎，得黃原膠樣品。

1.7黃原膠丙酮酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量黃原膠樣品加入0.1 mol/L的HCl溶液，100 C水解4 h，取水解液采用2,4-

二硝基苯肼比色法[9]測(cè)定其丙酮酸含量。 2結(jié)果與討論

2.1菌體對(duì)氧載體的可利用性

取菌懸液以10 %接種于E培養(yǎng)基，再將正己烷、正十二烷、大豆油以及甲苯分別作為 唯一碳源以3 % (v/v)加入，以接種時(shí)細(xì)胞干重作對(duì)照，每組均作雙樣，取平均值（以下 實(shí)驗(yàn)均同），培養(yǎng)3d,采用干重法測(cè)定細(xì)胞生物量的變化，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié) 果見(jiàn)圖2。

從圖中可以看出，培養(yǎng)3d后細(xì)胞生物量只有略微増加，這可能是受離心不徹底培養(yǎng)基 雜質(zhì)的影響。由此可知野油菜黃單胞菌不能利用這三種有機(jī)物作為碳源。因此，這些有機(jī)物 在發(fā)酵過(guò)程中的作用應(yīng)該是提高供氧能力。對(duì)有機(jī)物甲苯，在培養(yǎng)1d后有絮狀沉淀產(chǎn)生， 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)生大量絮狀沉淀，鏡檢觀察不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能因?yàn)榧妆綄?duì)細(xì)胞的刺激和毒性 較強(qiáng)，嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，不適宜作為氧載體在本實(shí)驗(yàn)中使用。

2.2氧載體加入量對(duì)黃原膠產(chǎn)率的影響

發(fā)酵初期，發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2 %?12 % (v/v)不同濃度的正己烷、正十二烷、 大豆油，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖中可以看出，加入大豆油使黃原膠產(chǎn)率有明顯提高，與未加大豆油的對(duì)照組相比， 黃原膠產(chǎn)率由1.64 %増加到2.41 % (加入6 %大豆油）。隨著大豆油加入量的増加，產(chǎn)率反 而下降，這可能是因?yàn)殡m然氧載體能提高溶氧能力，但由于培養(yǎng)基失水較多，影響產(chǎn)率；另 外，表觀粘度的不斷増加會(huì)影響氧傳質(zhì)系數(shù)[6]。

對(duì)于氧載體正己烷與正十二烷，隨著加入量的増加，黃原膠產(chǎn)率均呈下降趨勢(shì)，這可能 是因?yàn)榇藵舛鹊挠袡C(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，產(chǎn)率降低；又或者此種氧載體影響了黃原膠 合成的相關(guān)酶的基因的表達(dá)，從而對(duì)黃原膠合成過(guò)程造成不可修復(fù)的損傷。為進(jìn)一步確定正 己烷與正十二烷對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響原因，分別添加0.25 %?2 % (v/v)不同濃度的正己烷、 正十二烷，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4氧載體低加入量對(duì)黃原膠產(chǎn)率的影響 Fig.4 Effects of low concentration of oxygen vectors addition on xanthan gum yield

從圖中可以看出，低濃度正己烷（1%)的加入使黃原膠的產(chǎn)率有明顯提高，與未加正 己烷的對(duì)照組相比，黃原膠產(chǎn)率由1.60 %増加到2.45 %;而正十二烷的加入并沒(méi)有使產(chǎn)率 得到提到，隨著加入量的増加，產(chǎn)率仍呈下降趨勢(shì)。因此正十二烷不適宜作為氧載體在本實(shí) 驗(yàn)中使用。

2.3氧載體加入時(shí)間對(duì)產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵不同時(shí)期，分別添加6 % (v/v)的大豆油與1 % (v/v)的正己烷，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5不同發(fā)酵時(shí)間添加氧載體對(duì)黃原膠產(chǎn)率的影響 Fig.5 Effects of oxygen vectors added on xanthan gum yield during fermentation

從圖中可以看出，在發(fā)酵初期加入大豆油，黃原膠產(chǎn)率為2.41 %，此后加入，黃原膠 產(chǎn)率逐漸降低。在發(fā)酵12 h加入正己烷，黃原膠產(chǎn)率能達(dá)到2.95 %。有機(jī)溶劑的疏水參數(shù) (Log P)越高，則證明有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的刺激或者毒性越小，生物相容性越好。Laane等 曾提出生物相容性較佳的有機(jī)溶劑其疏水參數(shù)Log P>4[10]，正己烷的Log P為3.5,生物相 容性不夠好，在發(fā)酵初期加入可能會(huì)因?yàn)槎竞w致使黃原膠產(chǎn)率不高，經(jīng)過(guò)一段細(xì)胞適應(yīng) 期后再添加正己烷更有利于發(fā)酵進(jìn)行。

不論添加大豆油或正己烷與否，發(fā)酵過(guò)程pH值的變化是相對(duì)穩(wěn)定的。 發(fā)酵整個(gè)過(guò)程中，尤其是發(fā)酵中、后期，添加正己烷的發(fā)酵液pH值均比另外兩組偏高，推 測(cè)正己烷在發(fā)酵過(guò)程中不僅起到氧載體的作用，也對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生影響，改變了 細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的過(guò)程。黃原膠中丙酮酸含量的高低與膠性能的優(yōu)劣密切相關(guān)，是 黃原膠質(zhì)量的重要標(biāo)志。從圖8可以看出，氧載體大豆油或正己烷的加入對(duì)黃原膠質(zhì)量的影 響不大，黃原膠丙酮酸含量分別為3.92 °%和3.18 °%。添加大豆油的黃原膠丙酮酸含量比對(duì) 照組（3.33%)偏高，這可能是因?yàn)檠娱L(zhǎng)了大豆油添加組的發(fā)酵時(shí)間[12]。

3結(jié)語(yǔ)

大豆油和正己烷不能作為碳源被黃單胞菌利用，在黃原膠發(fā)酵體系中是一種非常有效的 氧載體，均能提高黃原膠產(chǎn)率。正十二烷雖不能作為碳源被黃單胞菌利用，但對(duì)黃原膠發(fā)酵 產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用，隨加入量的増加，黃原膠產(chǎn)率逐漸下降。

在發(fā)酵初期添加大豆油6 % (v/v)發(fā)酵84 h,黃原膠產(chǎn)率可達(dá)3.02 %,產(chǎn)率提高89 %; 在發(fā)酵12 h添加正己烷1 % (v/v)發(fā)酵72 h,黃原膠產(chǎn)率可達(dá)2.95 %,產(chǎn)率提高84 %;大 豆油和正己烷的加入均沒(méi)有對(duì)黃原膠的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。