黃原膠是野油菜黃單孢菌以碳水化合物為主要原料，經(jīng)好氧 發(fā)酵生物工程技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)的一種用途廣泛的細(xì)菌胞黃單胞菌外多糖，在 化工、食品、醫(yī)藥、紡織、采油和化妝品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，是 目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大且用途極為廣泛的微生物多糖[1]。紫外 線是一種使用最早、沿用最久且應(yīng)用效果明顯的微生物誘變劑， 其誘變頻率高，迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變劑 之一。本論文旨在通過對黃單胞菌的紫外線誘變及紫外線-亞硝 酸鈉復(fù)合誘變，篩選獲得黃原膠產(chǎn)量較高和質(zhì)量較好的菌株，為 產(chǎn)黃原膠菌株的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

 

1實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1菌株本實(shí)驗(yàn)室保存的Xcc8004野油菜黃單胞菌菌株。本實(shí)驗(yàn)室從 各地采集的野油菜黃單胞菌野生菌株cam26-cam47。

 

1.2培養(yǎng)基1.2.1 NYGA培養(yǎng)基（100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g， 蔗糖2g，瓊脂粉1.5g，pH7.01.2.2 NYGB培養(yǎng)基（100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g， 蔗糖 2g， pH7.01.3出發(fā)菌株的篩選將菌株活化，接人裝有10ml滅菌NYGB培養(yǎng)基的指形瓶中， 28°C，200rpm搖床培養(yǎng)16小時。取菌液稀釋到10-5、10-6、10-7 三個濃度，用移液槍分別吸取100微升，均勻涂布在NYGA培養(yǎng)基 平板上，每個濃度涂兩個平板。28C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，觀 察平板上單菌落的形態(tài)，用游標(biāo)卡尺測量單菌落的直徑，從每個 平板中選出最大的1個單菌落，測量其直徑、記錄、保藏。對來 自同一個菌株的菌落所得各新菌株，在同一平板上點(diǎn)板，培養(yǎng)5天， 觀察、測量單菌落的直徑，從中選出菌落直徑最大的菌株，作為 該野生菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株。將不同野生菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株在同一平板 上點(diǎn)板，培養(yǎng)5天，觀察平板上單菌落的形態(tài)、測量單菌落的直徑， 進(jìn)行菌株間對比，確定誘變出發(fā)菌株。

 

1.4不同強(qiáng)度的紫外線誘變分別吸取培養(yǎng)16小時的菌液2ml置于三個無菌平皿中，開蓋， 不同距離，15W紫外燈下照射40S。誘變后的菌液10-5、10-6、10-7 稀釋涂平板，各涂兩個平板，28C恒溫培養(yǎng)3天，觀察平板上單 菌落的形態(tài)、計(jì)菌落數(shù)，從每個平板中選出較大的若干個單菌落， 測量其直徑、記錄、編號保藏。

 

1.5不同時間的紫外線誘變分別吸取培養(yǎng)16小時的菌液2ml置于三個無菌平皿中，開 蓋，用15W的紫外燈在40cm距離下分別照射不同時間。誘變后處理同上。

 

1.6紫外線-亞硝酸鈉復(fù)合誘變?nèi)∨囵B(yǎng)16小時的2ml菌液放人滅菌指形瓶中，用醋酸溶液調(diào) 節(jié)pH到4.5，加人等體積的0.07mol/L的亞硝酸鈉溶液，在28C 水浴中處理120S，調(diào)節(jié)pH到7.0,再置于無菌平皿中、開蓋，在 15W紫外燈下40cm距離處照射40S。誘變后處理同上。

 

誘變所得菌株的初篩：從每一個誘變處理的6個平板中，觀 察各個平板中菌落形狀較大、菌落比較飽滿光滑的菌落，選擇較 大的幾個菌落測量其直徑大小，挑選出菌落直徑最大的1個菌株， 點(diǎn)平板；將6個平板中各平板的直徑最大菌落的菌株都點(diǎn)接在同 一個NYGA平板上，28C培養(yǎng)5天，從該平板中選出直徑最大菌落 的1個菌株，培養(yǎng)、編號保存。

 

誘變所得菌株的復(fù)篩：將初篩得到的菌株分批進(jìn)行復(fù)篩，一 批取7-8個菌株點(diǎn)接在同一個NYGA平板上，28C培養(yǎng)5天，觀察、 測量各菌落直徑，進(jìn)行比較。選取直徑最大的2個菌落的菌株， 培養(yǎng)、保存。對各批復(fù)篩所得菌株按上述方法進(jìn)行二次復(fù)篩、三 次復(fù)篩、多次復(fù)篩；直至選出幾株直徑較大菌落的菌株。

 

1.7侯選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)1.7.1種子液搖瓶培養(yǎng)從所選菌落中挑取少量菌苔于含10mlNYGB 培養(yǎng)基的指形瓶中，28C，200rpm搖床培養(yǎng)16h。

 

1.7.2搖瓶發(fā)酵取經(jīng)過夜培養(yǎng)的菌液2.5ml接人含100mlNYGB培 養(yǎng)基的三角瓶中，28C，180rpm搖床培養(yǎng)4天。

 

1.8黃原膠的提取用移液槍吸取20ml發(fā)酵液置于50ml離心管中，在4C， 10000rpm條件下離心30min。將離心后的上清液倒人燒杯中，加 人3-7倍體積的95%乙醇，用玻璃棒攪拌，在攪拌過程中上清液 會產(chǎn)生絮狀凝聚物，帶絮狀物聚集完后取出放在干凈的平皿上。 剩余的液體通過濾紙過濾，將上清液中剩余的沉淀過濾出來，把 濾紙上的絮狀物轉(zhuǎn)移到平皿上。用乙醇多次洗滌絮狀物，然后把 裝有絮狀物的平皿放人40C烘箱中烘干，當(dāng)平皿的重量不變時， 把干燥的黃原膠粉末刮下，稱量其重量。

 

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1出發(fā)菌株的篩選出發(fā)菌株的選擇是決定誘變效果的重要環(huán)節(jié)，長期育種的經(jīng) 驗(yàn)證明，在誘變處理前下功夫選擇一株好的出發(fā)菌株是很重要的[2]。本實(shí)驗(yàn)將22株野生黃單胞菌菌株分別進(jìn)行平板涂布篩選，測 量長出的單菌落直徑，每個平板上選出直徑最大的菌落點(diǎn)板培養(yǎng)， 五天后觀察生長情況，經(jīng)多批、多次反復(fù)點(diǎn)板培養(yǎng)對比，將各菌 株最大單菌落的直徑列于表1。

 

表1黃單胞菌各菌株最大單菌落的直徑（mm)

 

菌株最大直徑菌株最大直徑菌株最大直徑菌株最大直徑cam262.76cam329.3cam387.86cam4413.3cam275.54cam3310.46cam398.54cam4514.6cam2813.94cam346.72cam4012.86cam4614. 16cam299.1cam356.2cam418.52cam4710.6cam3011.48cam365.56cam4213.24cam314.08cam379.22cam4310.42. 5誘變菌株的對比取各批次誘變所得菌落直徑最大的7株菌株重新編號為 46-1、46-2、46-3、46-4、46-5、46-6、46-7 (平板上簡寫為：1、 2、3、4、5、6、7)，點(diǎn)在同一個平板上，以便于菌株間的對比， 培養(yǎng)三天后生長情況如圖1。

 

誘變的出發(fā)菌株的選擇，主要考慮生長速度快（意味著發(fā)酵 生產(chǎn)成本低），菌膠團(tuán)大（意味著黃原膠產(chǎn)量高）兩方面。從表 1可見，cam45菌株菌落直徑最大，cam46菌株菌落直徑第二大； 在觀察菌落形態(tài)時發(fā)現(xiàn)，cam46菌株菌落的菌膠團(tuán)比cam45菌株 菌落的菌膠團(tuán)大一些；考慮到cam46菌株與cam45菌株菌落直徑 相差不大，而cam46菌株的菌膠團(tuán)較大；故選擇cam46號菌株作 為誘變育種的出發(fā)菌株。

 

2 2不同照射時間下黃單胞菌的紫外線誘變?nèi)am46菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行誘變育種。本實(shí)驗(yàn)釆用紫 外線照射的方法進(jìn)行誘變育種，由于紫外線的穿透能力不強(qiáng)，不 能穿透培養(yǎng)皿的皿蓋，故誘變時須打開培養(yǎng)皿在紫外燈下照射， 照射距離為40cm，各試驗(yàn)組分別照射40S，80S，120S，誘變后結(jié) 果見表2。根據(jù)前人的研究經(jīng)驗(yàn)，紫外線照射的致死率在70%左 右時，產(chǎn)生正突變的幾率較高，有利于進(jìn)一步篩選[3]，故選擇致 死率為69.6%的照射時間80S為最佳紫外線照射時間。

 

表2不同照射時間的致死率處理時間（S)存活菌落數(shù)（個/ml)存活率（%)致死率（%)

 

405.33X10838.661.4804.20X10830.469.61202.47X10817.982.1對照組1.38X10910002.3不同照射強(qiáng)度下黃單胞菌的紫外線誘變紫外線照射強(qiáng)度與照射距離的平方成正比關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)直接 用不同的照射距離來代表不同的照射強(qiáng)度。取cam46菌株培養(yǎng)后， 打開培養(yǎng)皿在紫外燈下分別照射80S，設(shè)置的照射距離為20cm、 30cm、 40cm， 誘變后結(jié)果見表 3。

 

圖1誘變所得菌株初次點(diǎn)板對比根據(jù)圖1的菌株生長情況，淘汰生長速度慢、菌落明顯偏小 的46-5菌株，取其他菌株同時進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定其黃原膠產(chǎn)量。 2.6黃原膠發(fā)酵與產(chǎn)率的計(jì)算取 46-1、46-2、46-3、46-4、46-6、46-7 菌株和 Xcc8004 標(biāo) 準(zhǔn)菌株及46號出發(fā)菌株一起發(fā)酵，經(jīng)16小時液體種子培養(yǎng)后， 在每100mlNYGB培養(yǎng)基中接種2.5ml種子培養(yǎng)基，28°C，180rpm 條件下在搖床中培養(yǎng)四天。

 

取20ml發(fā)酵液置于離心管中，10000rpm離心30min，除去沉 淀后，上清液加人3-7倍體積的95%乙醇，用玻璃棒攪拌，等絮 狀沉淀不再增多后，把玻璃棒上的沉淀取下放在干凈的培養(yǎng)皿中， 發(fā)酵液通過濾紙過濾，將沉淀出來的黃原膠用乙醇洗滌后放人烘 箱中烘干至恒重，稱量其干重。Xcc8004及誘變育種所得菌株產(chǎn) 膠率見表 5。

 

表3不同照射距離的致死率距離（cm)存活菌落數(shù)（個/ml)存活率（%)致死率（%)

 

202.39X10820.379.7303.41X10828.971.1403.94X10833.466.6對照組1.18X1091000表 5 各菌株黃原膠產(chǎn)量菌株產(chǎn)膠量（g/L)菌株產(chǎn)膠量（g/L)

 

Xcc80040.446-32.01Cam462.246-42.0546-11.546-6146-21.0346-72.332.4黃單胞菌的紫外線-亞硝酸鈉復(fù)合誘變育種亞硝酸鈉誘變作用PH為4.5，終止反應(yīng)時PH為6.8 [4]，進(jìn) 行紫外線-亞硝酸鈉復(fù)合誘變復(fù)合誘變時，先對菌種進(jìn)行亞硝酸 鈉誘變，亞硝酸鈉處理時間120S，然后將PH調(diào)至7.0終止反應(yīng)， 再取2ml亞硝酸鈉處理后菌液進(jìn)行紫外誘變，紫外線照射時間 40S，距離40cm，復(fù)合誘變后結(jié)果見4。

 

從上表中可以看出，黃原膠產(chǎn)量最高的46-7菌株產(chǎn)量為 2.33g/L，比出發(fā)菌株黃原膠產(chǎn)量增加了 0.13g/L，增產(chǎn)幅度為 5.9%;與本室保存的Xcc8004標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，46-7菌株的黃原膠 產(chǎn)量提高了 4.8倍。

 

3小結(jié)和討論本文以本實(shí)驗(yàn)室從野外分離出的一批黃單胞菌菌株為原始 菌株，釆用多次平板涂布方法分離出生長較快的菌株，再經(jīng)過 多次復(fù)篩，最終選擇生長較快且透明圈較大的cam46號菌株作 為誘變的出發(fā)菌株。論文釆用紫外線誘變和紫外線-亞硝酸鈉 復(fù)合誘變，通過不同照射時間、不同照射距離來改變紫外線照 射的強(qiáng)度和劑量，并用紫外線和亞硝酸鈉同時作用的方法提高 黃單胞菌的突變率。

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