絲素蛋白膜具有無毒性、無刺激作用、透濕性好等許多優(yōu)異性能，作為生物材 料具有廣闊的前景，可用于研制人工皮膚來修復(fù)、治療燒傷、燙傷等患者【1]。在以 上四章中，已對共混膜的物理性能進(jìn)行了研究，可知反應(yīng)時(shí)間在1.5h、反應(yīng)溫度 在3(TC-5(TC、在絲素含量大于50%時(shí)，所得尿素共混膜的性能較好。本章中對

這些條件下得膜，來進(jìn)一步研究。

醫(yī)用的生物材料要直接接觸人體組織細(xì)胞或血細(xì)胞，所以必須考慮到其生 物安全性。材料血液相容性的評價(jià)方法為采用體外培養(yǎng)細(xì)胞方法評價(jià)生物材料的 細(xì)胞毒性以及用血檢測生物材料的血液相容性，這已被認(rèn)為是一種有效的檢測技 術(shù)。溶血試驗(yàn)除了作為血液相容性評價(jià)的試驗(yàn)之一，還作為急性毒性的一個(gè)體外 篩選試驗(yàn)，在生物安全性評價(jià)中起著重要的作用。對于材料的血液相容性，由于 其影響的因素很多，機(jī)制復(fù)雜，涉及血液學(xué)、工程材料和材料科學(xué)的廣泛領(lǐng)域。 所以對于“血液相容性”的測試，沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)化，對不同的材料具體的結(jié)果 也不一樣的。但有不少學(xué)者將抗凝血性、不壞血液成分及不改變血液生理環(huán)境 的特征定義為材料的血液相容性P]。六十年代初，美國國家衛(wèi)生研究院（NH)幵 創(chuàng)了血液相容性的試驗(yàn)評價(jià)方法實(shí)驗(yàn)。之后，發(fā)展出來很多種評價(jià)材料的血液相 容性的方法?？偟膩碚f，這些方法可以歸納為體內(nèi)法' 半體內(nèi)和體外法三種(見表 5-1)。

表5-1生物材料的血液相容性評價(jià)實(shí)驗(yàn)

環(huán)境試驗(yàn)方法檢測目的方法的優(yōu)缺點(diǎn)

體內(nèi)將材料植入體內(nèi)， 觀察材料表面的血栓形成 情況，材料的變化以及在 體內(nèi)各部分位產(chǎn)生的微小 血檢組織結(jié)構(gòu)變化。在機(jī) 體方面，還觀察血小板等 血液成分的損傷。動(dòng)物試 驗(yàn)。在接近使用狀態(tài)的 條件下，綜合評價(jià)材料和 機(jī)體兩方面的變化和程 度，弄清數(shù)周、數(shù)月間 BM1的狀況。（血液和材 料的相互作用Blood — Material Interaction,簡 稱 BMI)實(shí)驗(yàn)接近材料的使 用條件，結(jié)果具有準(zhǔn)確性 和真實(shí)性。但手術(shù)復(fù)雜、 時(shí)間長、不易定性、定量 分析。痛時(shí)，由于動(dòng)物使 用的體系和人有差異，常 造成自相矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。

半體內(nèi)在體外的血液分流 回路中設(shè)置試驗(yàn)腔，觀察 試驗(yàn)材料表面血漿、血小 板、紅細(xì)胞數(shù)量的以及結(jié) 構(gòu)、形態(tài)的變化和血栓形 態(tài)等B動(dòng)物試驗(yàn)。在與使用狀態(tài)大致 相近的條件下，測定材料 表面與血液的反應(yīng)性，尤 其是血栓本身的生成程 度，弄清數(shù)天間BMI的 狀況。二次篩選。與材料使用條件較 接近。速度快、靈敏度 髙，接近臨床實(shí)驗(yàn)。

體外讓血液和材料接 觸，觀察材料表面的血漿 蛋白、血小板、白細(xì)胞、 紅細(xì)胞等的數(shù)量及其結(jié)構(gòu) 形態(tài)的變化。另殲，還觀 察血液中凝血因子的變 化。血液為人或動(dòng)物血測定材料表面與血 漿蛋白、血小板、白細(xì) 胞、紅細(xì)胞等的反應(yīng)程 度，弄清BM1的初期狀

況初篩。靈敏、快速及經(jīng)濟(jì) 的特點(diǎn)。易受環(huán)境影響， 準(zhǔn)確性差

_ _

本章釆用體外試驗(yàn)法測定了共混膜的體外溶血試驗(yàn)、復(fù)鈣試驗(yàn)和血小板擴(kuò)張 試驗(yàn)。用快速、敏捷而又經(jīng)濟(jì)的方法體外法對共混膜的血液相容性進(jìn)行比較研 究，研究材料在血液相容性方面的效果。

5.1實(shí)驗(yàn) 5.U實(shí)驗(yàn)材料

各試樣號(hào)及組成為：1#純絲素蛋白膜；反應(yīng)時(shí)間為1.5 h、反應(yīng)溫度為3(TC 下制得的共混膜:2#樣，絲素/竣甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、3#樣尿素(10%)/絲素 /竣甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、4#樣尿素(20%)絲素/竣甲基纖維素鈉 (FM6)(80/20)膜

5丄2實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)由暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所完成。實(shí)驗(yàn)采用的血樣為醫(yī)院血液中心新鮮 抗凝血。

5.1.2.1溶血試驗(yàn)【34]

原理：將試樣與血液直接接觸，測定紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白量，以檢測試樣 體外溶血程度。血紅蛋白的吸收波長為545納米，可用分光光度計(jì)(上海棱光722s 分光光度計(jì) > 檢測其濃度。

實(shí)驗(yàn)方法：

1.所用玻璃試管和其它與血液接觸制品統(tǒng)一硅化處理。試樣切成Icmxlcm的塊 狀。

2.取抗凝血8毫升，加0.9%氯化鈉注射液10毫升稀釋。

3.取硅化試管，分別裝試樣和氯化鈉注射液1〇毫升、蒸餾水1〇毫升。

4.全部試管在37度水浴中恒溫30分鐘，分別加(U毫升抗凝血，并在37度保溫

60分鐘。'

5.1200轉(zhuǎn)離心3分鐘，取試管上層清液，在545納米波長處測定吸光度。溶血率

如下式計(jì)算，

溶血率 a (%〉^Ds~Dnx\m

Dp-Dn

式中：Ds，試樣平均吸光度；Dn,陰性組吸光度；Dp，陽性組吸光度。

6.溶血率小于5%的為合格。

5X2.2復(fù)鈣試驗(yàn)

該試驗(yàn)是測試試樣阻止血漿白蛋白與鈣離子結(jié)合作用的能力&

試驗(yàn)步驟：

1.按一份防凝劑的草酸鈉溶液）加9份血液的比例混合，制成防凝 血。直接取抗凝血，在離心機(jī)上以1〇〇0轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，取上層富含血

小板的血清。

2.將待測試樣剪成約1厘米見方的方塊，置于小試管中，加入0.1ml富含血 小板血漿，37度水浴恒溫讓試樣與血液接觸1小時(shí)，再加入37度0.5%的新配置 氯化鈣溶液0,1ml，立即計(jì)時(shí)，不斷輕輕搖動(dòng)試管，至出現(xiàn)白色纖維蛋白膜時(shí)，

記錄所需時(shí)間。

5.1,2.3血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)

該試驗(yàn)是通過測試血小板與材料表面相互作用，探討材料對血小板的相容性。

試驗(yàn)方法：直接取抗凝血20ml，以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離5分鐘，取上清 液以1: 4.5的比例加稀釋液（9份生理鹽水加1份2%草酸鉀配置），制成富含 血小板的血漿。用此血清37度下恒溫接觸材料30分鐘，然后用稀釋液沖詵三 次。2,5%戊二醛固定30分鐘后，依次用CUM磷酸置換三次，每次10分鐘，用 50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇各脫水一次，每次10分鐘，醋酸異 戊酯置換三次，每次5分鐘，干燥后置于掃描電鏡(Hitachi S520/ISIS-300)下觀察 材料表面上血小板粘附情況。

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 S.2.1溶血率

溶血率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表54中，不同材料的溶血率見表5-U各種材料的溶 血率由小到大的順序排列為：3#<2#<4#<1#。溶血率的大小反映了材料對紅細(xì)胞 造成破壞引起溶血的程度，以溶血率指標(biāo)評價(jià)各種試驗(yàn)材料的血液相容性，溶血 率小于5%的為合格。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，材料的溶血率都小于5%，所以共混膜都 為合格。但具體的膜的血液相容性還存在差別，反應(yīng)時(shí)間為1.5h，反應(yīng)溫度為 3(TC下制得的共混膜=2#絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、3#尿素(10%)/絲素， 羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20>膜最好，1#純絲素膜、4#尿素(20%)絲素/羧甲基纖維 素鈉(FM6)(80/20)膜次之。結(jié)果表明，用適當(dāng)?shù)哪蛩刈冃詣└男?，能有效的改?材料的溶血率。

表5-1各種材料的溶血率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

樣品號(hào)1#2#3#4#

溶血率(％)2.8%KS%1.3%2.0%

5.2.2復(fù)鈣時(shí)間

復(fù)媽試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表5-2中，不同材料的復(fù)鈣時(shí)間見表5-2。各種材料 的復(fù)釣時(shí)間由大到小的順序排列為：3#〉2#> 1#。復(fù)鈣時(shí)間的大小反映了材 料對紅蛋白纖維的沉淀作用，復(fù)鈣時(shí)間越長，證明材料對蛋白纖維的沉淀作用越 小。以復(fù)鈣時(shí)間指標(biāo)評價(jià)各種材料的血液相容性，對反應(yīng)時(shí)間為15 h、反應(yīng)溫 度為30°C下制得的共混膜：4#尿素(20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜最 好，2#絲素傲甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、3#尿素(10%)/絲素/羧甲基纖維素鈉 (FM6)(80/20)膜次之，^純絲素膜最差■■結(jié)果表明，用適當(dāng)?shù)哪蛩刈冃詣└男詜 能有效的改善材料的復(fù)鈣時(shí)間。

表5-2各種材料的復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

樣品號(hào)1#2#3#4#

復(fù)鈣時(shí)間(秒）20025Q282300

5.2.3血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)

血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表5-3中,不同材料的血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的掃描 電鏡圖見圖5-1。血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的實(shí)驗(yàn)反映了血小板與材料表面相互作用，材料 對血小板的相容性。以血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)指標(biāo)評價(jià)各種材料的血液相溶性，血小板 粘附情況表明，對反應(yīng)時(shí)間為1.5h，反應(yīng)溫度為30°C下制得的共混膜:3#尿素 (10%)/絲素/竣甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜對血小板黏附太多，不是理想的材 料；4#尿素(20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、2#絲素/羧甲基纖維素鈉 (FM6)(80/20)膜和1#純絲素膜是理想材料。

表5-3各種材料的血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與掃描電鏡圖

樣品號(hào)1#2#3#4#

血小板粘附■血小板很少 (10微米左右）、 無明M變形、表 面均質(zhì)比1#粘附稍

多，放大后無填 充物粘附血小板 多，但變形不明 顯粘附血小板很少

3#4#

圖5-1血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)的掃描電鏡圖

S.2.4各種材料血液相容性的綜合評價(jià)

通過以上三個(gè)指標(biāo)的測定，由單個(gè)指標(biāo)初步評價(jià)了各種材料的血液相容性的 優(yōu)劣。但同一材料的血液相容性指標(biāo)不—定匹配，主要是測試的作用機(jī)理不—

樣，影響因素繁多。通過這些測試結(jié)果的綜合分析[53,可大致確定理想材料的范 圍。本實(shí)驗(yàn)中可確定理想材料為反應(yīng)時(shí)間為1.5 h，反應(yīng)溫度為30X：下制得的尿 素(10%-20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜。

S.3小結(jié)

(1)通過溶血率實(shí)驗(yàn)測試得出，反應(yīng)時(shí)間為L 5 h,反應(yīng)溫度為3(TC下制得的 共混膜:絲素/竣甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、尿素(10%)/絲素/羧甲基纖維素鈉 CFM6)(80/20)膜的血液相容性最好。

(2)通過復(fù)鈣試驗(yàn)得出，反應(yīng)時(shí)間為1. 5 h,反應(yīng)溫度為30°C下制得的共混膜: 尿素(20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6X80/20)膜的血液相容性最好。

(3)通過血小板擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)得出，反應(yīng)時(shí)間為1. 5 h，反應(yīng)溫度為30°C下制得的 共混膜：尿素(20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(80/20)膜、絲素/羧甲基纖維素鈉 (FM6)C80/20)膜和純絲素膜是理想材料。

(4)綜合考慮可確定理想材料為反應(yīng)時(shí)間為1. 5 h，反應(yīng)溫度為30°C下制得的

尿素(10%-20%)絲素/羧甲基纖維素鈉(FM6)(8〇/2〇)膜。

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