由木醋桿菌合成的細(xì)菌纖維素化學(xué)組成上與植物纖 維素相同,但與植物纖維素相比，具有純度高、結(jié)晶度高、 重合度高、吸水性強(qiáng)、抗張強(qiáng)度好、生物適應(yīng)性強(qiáng)等獨(dú)特 的性質(zhì)[1]。目前國(guó)外通過(guò)改變生物合成環(huán)境下的物理、 化學(xué)或生化條件來(lái)改變纖維素裝配的高度序列結(jié)構(gòu)及其 產(chǎn)量，即在細(xì)菌纖維素發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加一些物質(zhì)（如 熒光增白劑）阻礙正常絲帶裝配并改變了產(chǎn)物的晶體結(jié) 構(gòu)和性質(zhì)[2];半纖維素影響纖維素分子的晶體結(jié)構(gòu)及形 狀[3];水溶性多糖（瓊脂[4]、acetan[5]等）阻礙大團(tuán)塊的纖 維素的生成，增加溶氧從而提高產(chǎn)量;木素磺酸鹽影響靜 態(tài)培養(yǎng)條件下BC產(chǎn)量、晶體結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)[M]等。由 于細(xì)菌纖維素在動(dòng)態(tài)條件下存在嚴(yán)重結(jié)團(tuán)和菌株逐級(jí)放 大后生產(chǎn)穩(wěn)定性差的2大難題,導(dǎo)致產(chǎn)量較低，而添加羧 甲基纖維素鈉能有效解決，故本研究主要考察^^〇6〇〇時(shí) NUST4. 1在動(dòng)態(tài)條件下添加竣甲基纖維素鈉對(duì)細(xì) 菌纖維素產(chǎn)量的影響，并探討采用動(dòng)靜二步發(fā)酵法進(jìn)一 步提高纖維素產(chǎn)量。

　　

　　1材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料AcetoiacterNUST 4_ 1:由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

　　

　　固體培養(yǎng)基:葡萄糖3.0%,蛋白胨1.0%,檸檬酸 0_ 115% ,碟酸氫二鈉0• 27% ,硫酸鎂0• 025% ,瓊脂2.0%， pH 6.0;種子培養(yǎng)基:葡萄糖2.0% ,玉米漿干粉0.6% ,硫酸 銨0.6% ,鱗酸二氫鉀0• 1% ,硫酸鎂〇• 04% ,PH 6_ 0;發(fā)酵培 養(yǎng)基:葡萄糖1. 8% ,蔗糖2.1% ,玉米漿干粉2.0% ,硫酸銨 0.4%，醋酸0.06% ,磷酸二氫鉀0• 2% ,硫酸鎂0.04%，pH 6.0。發(fā)酵罐中需加消泡劑0_ 05mL/L。

　　

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法搖瓶培養(yǎng):種子培養(yǎng)基中接入斜面菌種后，于28T、 15〇r/min振蕩培養(yǎng)18h,按8%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液 中，于29丈、180r/min振蕩培養(yǎng)5d,其中向發(fā)酵培養(yǎng)液中添 加不同濃度的 CMC-Na(0.02%、0.04%、0.06%、0• 08% ), 平行實(shí)驗(yàn)3組。

　　

　　發(fā)酵罐培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基中接人斜面菌種后，于 (28 ± 1 )丈、150r/min振蕩培養(yǎng)18h,按8%接種量接種于經(jīng) 原位滅菌的添加了 0.06% CMC-Na的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在機(jī) 械攬拌發(fā)酵罐（比歐L1523,瑞士）中實(shí)驗(yàn),調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速 300r/min,培養(yǎng)溫度（28 ± 1)尤，罐壓0.03MPa,通氣量 0.5iy(L.min),平行實(shí)驗(yàn)3組。

　　

　　1.3分析方法pH值測(cè)定:使用PHS-2型PH計(jì);菌種變異情況測(cè)定： 發(fā)酵液稀釋涂布看菌落形態(tài);殘還原糖測(cè)定:改進(jìn)的DNS 法[8];纖維素產(chǎn)量和菌重測(cè)定:參照參考文獻(xiàn)[9^2結(jié)果與討論2.1添加CMC-Na對(duì)搖瓶條件下產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響考察添加不同濃度的CMC-Na對(duì)搖瓶培養(yǎng)收稿日期:2〇〇8"〇3-12作者簡(jiǎn)介:孫東平U970-),男，江蘇連云港人,副教授，研究方向?yàn)槲⑸锷砩皯?yīng)用。

　　

　　NUST4. 1產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。添加 0.06%羧甲基纖維素鈉較佳，其纖維素產(chǎn)量是未添加時(shí)的 1.94倍，產(chǎn)量提高非常明顯，而且改變了細(xì)菌纖維素在發(fā)酵 液中的形狀，由大團(tuán)塊變?yōu)榇笮〔灰坏男F(tuán)塊分散于發(fā)酵 液中，根據(jù)pH值變化可知添加適量CMC-Na能調(diào)節(jié)pH值， 但當(dāng)其濃度達(dá)一定程度時(shí)，因發(fā)酵液初始黏度增加而抑制• 42 •2008 No. 24 Serial No. 201China BrewingResearch Report細(xì)胞生長(zhǎng)，致使纖維素產(chǎn)量下降，究其原因可能是羧甲基纖 維素鈉是可溶性的，與纖維素具有一定的親和力，在水溶液 中帶一定電荷，在NUST4_ 1吐絲過(guò)程中 被吸附到微纖絲表面，阻止這些微纖絲的團(tuán)聚，另外其還可 通過(guò)物理交叉聯(lián)結(jié)引起氫鍵變化，導(dǎo)致纖維素形態(tài)發(fā) 生變化[1°]。

　　

　　圖 2 300r/min、1.0L/( L.min) (12h 前丨、〇• 75L/( L.min) (12h 后）組合的發(fā)醇過(guò)程變化Figure 2. Fermentation dynamics in the determined conditions 考察添加 〇• 06% CMC-Na 對(duì) yketofcackr NUST 4.1在發(fā)酵罐中產(chǎn)纖維素的影響（見(jiàn)圖2)。發(fā)酵 罐中未添加0.06% CMC-Na時(shí)，發(fā)酵液中纖維素分布不 均勻，易結(jié)團(tuán)，并纏繞在發(fā)酵罐的內(nèi)部零件（如pH電 極、溶氧電極、溫度傳感器、取樣管、攪拌軸、通氣管）上， 而發(fā)酵液極為清澈，致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和溶氧傳質(zhì)不均而限 制團(tuán)塊中菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌纖維素產(chǎn)量難以提 髙；當(dāng)添加0.06% CMC-Na后，上述的結(jié)團(tuán)和纏繞現(xiàn)象 消失了，呈均勻的絮狀懸浮物，原因是改變了發(fā)酵液的 流變學(xué)性質(zhì)，有利于細(xì)胞充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，產(chǎn)量 是未添加的1.95倍，效果與搖瓶培養(yǎng)吻合，但相比于搖 瓶條件下的低很多，原因是發(fā)酵罐中攪拌強(qiáng)度和溶氧比 搖瓶中大，使得細(xì)胞較搖瓶中生長(zhǎng)更旺盛，而代謝能力 變?nèi)酰硗馑a(chǎn)的纖維素的形狀兩者也不同，在發(fā)酵罐中 纖維素絮狀體的產(chǎn)生導(dǎo)致發(fā)酵液的黏度較搖瓶更大，黏 度在一定范圍內(nèi)有利于細(xì)胞生長(zhǎng),但黏度太高反而不利 于細(xì)胞利用底物，進(jìn)而抑制生長(zhǎng)。

　　

　　2.3分批發(fā)酵培養(yǎng)的工藝條件確定采用添加〇. 06%羧甲基纖維素鈉的優(yōu)化培養(yǎng)基考察發(fā) 酵罐參數(shù)(攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和過(guò)程中pH值的控制）對(duì) i4ceto6acter;ic；yZiniwn NUST4.1產(chǎn)纖維素的影響，以期進(jìn)一步 提高纖維素產(chǎn)量。

　　

　　2.3.1攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量的確定根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定考察發(fā)酵罐的不同轉(zhuǎn) 速和不同通氣量：轉(zhuǎn)速200r/min ~ 500r/min，通氣量 0.25L/(L.min) ~1.0L/(L.min)。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表安 排實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)組合1延滯期較 長(zhǎng);組合2的延滯期很短，纖維素在48h前隨菌體生長(zhǎng) 持續(xù)增加，48h后趨于平穩(wěn);而組合3延滯期不長(zhǎng)，纖維 素隨菌體生長(zhǎng)持續(xù)增加，但其更利于菌體生長(zhǎng)，纖維素 生成稍差些，從放罐時(shí)稀釋涂布發(fā)酵液發(fā)現(xiàn)有2種菌落 存在，一種為正常菌落，即表面光滑、易挑取、乳白色、粒 狀、干的小菌落，鏡檢為均勻細(xì)短桿;另一種為變異菌 落，即表面粗糙、白色、難挑取、濕的大菌落，鏡檢為長(zhǎng)粗 桿，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致;組合4過(guò)程中發(fā)現(xiàn)纖維素以更 細(xì)的絮狀物形狀分散于發(fā)酵液中，發(fā)酵液最粘稠，現(xiàn)象 同組合3。后結(jié)合實(shí)驗(yàn)，當(dāng)采用12h前設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速 300r/min，通氣量1.0iy(L‘min),12h后調(diào)整通氣量為 0.75L/(L.min)，轉(zhuǎn)速不變時(shí)，纖維素產(chǎn)量為2.89&/L，產(chǎn) 率別表1實(shí)驗(yàn)條件的安排和結(jié)果Table 1. Arrange of experimental conditions and results組合轉(zhuǎn)速/(r.min’1 )通氣量/[L*(L*min)]纖維素產(chǎn)量/ (g.L】）產(chǎn)[g*(L-h)'']12002(0.5)1.290.01223004(1.0)1.810.03834001(0.25)1.140.02445003(0.75)1.570.0312.3.2過(guò)程中pH值的確定由于培養(yǎng)液的pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)菌纖維素的合成 有很大影響[12],因此控制pH值有望提高纖維素。表2反 映了控制不同過(guò)程pH值時(shí)發(fā)酵參數(shù)的比較，從中可發(fā)現(xiàn)分 段控制時(shí)的纖維素產(chǎn)量、產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率都較高，發(fā)酵時(shí)間相 對(duì)較短，最終的菌重適中，當(dāng)pH值控制在4.5時(shí)，其發(fā)酵周 期最長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)率較低，當(dāng)pH值控制在5. 5時(shí)，其菌重最 高，纖維素產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率較低，說(shuō)明該pH值適合菌體生長(zhǎng), 不利于纖維素的積累。

　　

　　3結(jié)論羧甲基纖維素鈉是一種水溶性多糖,添加到發(fā)酵液 中能改變發(fā)酵液的流變學(xué)性質(zhì)——黏度,能影響/tceto* 6octo•町心mm NUST4. 1的生長(zhǎng)進(jìn)而影響細(xì)菌纖維素的產(chǎn) 量。結(jié)果表明，添加〇• 06% CMC-Na能有效解決發(fā)酵罐 中嚴(yán)重結(jié)團(tuán)和菌株逐級(jí)放大后生產(chǎn)穩(wěn)定性差的2大難 題，而且能顯著提高纖維素產(chǎn)量,優(yōu)化發(fā)酵罐基本工藝 (添加0• 06%羧甲基纖維素鈉作為發(fā)酵罐培養(yǎng)基;攪拌轉(zhuǎn) 速30〇r/min, 12h前控制通氣量為1.017(L_min), 12h后調(diào) 整為0• 7517( L.min)開(kāi)始不控制pH值，當(dāng)pH值下降為 低于5.0時(shí)，通過(guò)蠕動(dòng)泵滴加10% NaOH溶液控制pH值為 5. 〇),由此能獲得3.35g/L干纖維素，產(chǎn)率為0.08g/(L.h), 是基礎(chǔ)培養(yǎng)的3.1倍。